ADN

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Publicado por tornado 18/04/2009 @ 00:12

Tags : adn, genética, ciencias de la vida, ciencia

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Replicación de ADN

Función correctora exonucleasa 3' → 5' de las ADN polimerasas.

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservador, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena, complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

El experimento de Meselson y Stahl permitió demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello se hicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En consecuencia, el isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, haciéndolas más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento (división celular, que requiere la replicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó mediante una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación (figura 2.b) se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generación (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o híbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el 25% restante).

La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existían aún cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.

El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.

Los orígenes de replicación son los puntos fijos que estan a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.

Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular, además de ser fácilmente transformables. El método consistía en transformar cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de los codones que los codifican en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias transformantes en un "medio mínimo" (para que sólo pudieran crecer éstas), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción, aparecía con mayor frecuencia el gen de uno de los aminoácidos (el correspondiente a la "posición 1"), con una menor frecuencia el gen del aminoácido adyacente al primero ("posición 2"), el adyacente al segundo ("posición 3") aparecía con menor frecuencia que el segundo y así sucesivamente hasta el gen que ocupaba la última posición. El experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de transformación, que la replicación sigue un orden (es secuencial).

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas), que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o mnocatenario). Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación.

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se añade timidina marcada y luego sin marcar, y siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN. También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tuneko Okazaki (o Tsuneko Okazaki) en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada (en inglés, leading strand, que a veces se traduce por líder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en inglés, lagging strand), cuya síntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicación avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde.

La síntesis de la nueva cadena de ADN es llevada a cabo por ADN polimerasas, que emparejan los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con los desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN molde. Los dNTP que se usan en la replicación del ADN contienen tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5' de la desoxirribosa y dependiendo de la base nitrogenada serán dATP, dTTP, dCTP o dGTP. La reacción fundamental es una transferencia de un grupo fosfato en la que el grupo 3'-OH actúa como nucleófilo en el extremo 3' de la cadena que está en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosfato α (el más próximo a la desoxirribosa) del desoxirribonucleósido 5' trifosfato que entra, liberándose pirofosfato inorgánico y alargándose el ADN (al formarse un nuevo enlace fosfodiéster). A diferencia de la mayoría de procesos biológicos que ocurren en la célula en los que sólo se separa un grupo fosfato (Pi), durante la replicación se separan los dos últimos grupos fosfato, en forma de grupo pirofosfato (PPi).

A pesar de que la ADN polimerasa sólo tiene un sitio activo para emparejar los cuatro dNTPs diferentes, la unión correcta de los pares de bases A:T, C:G es posible basándose en la geometría de éstos: si la unión es incorrecta se produce un desplazamiento del fosfato α haciendo más difícil su unión al extremo 3'-OH y ralentizando así el ritmo de catálisis, lo que da lugar a que la ADN polimerasa añada preferentemente las bases correctas.

Las ADN polimerasas pueden añadir hasta 1000 nucleótidos por segundo. Esto es debido a su naturaleza procesiva, es decir, el número de nucleótidos que son capaces de añadir cada vez que se asocian al molde de ADN que van a copiar. Dado que la adición de los nucleótidos es un proceso que dura unos milisegundos, la velocidad de catálisis va a depender del tiempo que la ADN polimerasa permanece unida al ADN, esto es, de su procesividad.

El crecimiento de la cadena se produce en dirección 5' → 3', ya que se requiere de un grupo 3'-OH libre para el inicio de la síntesis puesto que éste es el que realiza el ataque nucleofílico sobre el fosfato α del dNTP, de forma que las ADN polimerasas requieren de un iniciador 3'-OH (que puede ser de ADN o ARN) llamado cebador que es sintetizado por la ARN primasa. El extremo 3' del cebador se denomina extremo cebador.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

Las principales ADN polimerasas en E. coli son las ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, ADN Pol IV y ADN Pol V, y cada una de ellas está especializada en una o más de estas funciones según cuál sea su papel en la replicación. Así, la ADN Pol I que es poco procesiva (añade entre 20 y 100 nucleótidos por acontecimiento de unión) es la encargada de la eliminación de los cebadores y el "relleno" del espacio que dejan con ADN (actividad exonucleasa 5' → 3' y actividad polimerasa 5' → 3'). La ADN Pol II está encargada de la reparación de ADN (actividades polimerasa 5' → 3' y exonucleasa 3' → 5'), la ADN Pol III que es muy procesiva es la principal encargada de la elongación del ADN (actividad polimerasa 5' → 3') durante la cual también realiza tareas de corrección (actividad exonucleasa 3' → 5'). Las ADN Pol IV y V, identificadas en 1999, estan involucradas en una forma poco comun de reparación del ADN.

A diferencia de lo que ocurre con la ADN Pol I, que sólo debe añadir unos 5-10 nucleótidos una vez eliminado el cebador, es importante que la ADN Pol III sí sea muy procesiva, y por esa razón suele formar parte de un complejo denominado holoenzima ADN Pol III que le da una mayor procesividad. Este complejo consta de diversas subunidades polipeptídicas encargadas cada una de una función, y que constituyen en su conjunto un dímero asimétrico: una mitad se encarga de la síntesis de la hebra adelantada y la otra mitad de la hebra rezagada. El corazón catalítico lo componen las subunidades α que corresponden a dos copias de la ADN Pol III, la subunidad ε con actividad correctora exonucleasa 3' → 5' y la subunidad θ cuya función podría ser la de ensamblar las otras dos; las subunidades τ mantienen la estructura dimérica; el complejo γ lo conforman las subunidades γ y δ cuya su función es la de aumentar la procesividad de la ADN Pol III; la subunidad β sujeta la ADN Pol III al ADN.

La primasa (que es parte de la molécula de ADN polimerasa α) sintetiza ARN cebadores y además comienza la elongación con DNA de las dos cadenas. Después se produce un cambio de polimerasa y entra la ADN polimerasa σ, que continúa la síntesis.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.

Para que pueda formarse la horquilla de replicación es necesario que las dos cadenas se separen para sintetizar el cebador y el ADN de la cadena de nueva síntesis. Para ello el ADN debe desenrollarse y el punto de partida viene determinado por una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación; en E. coli, el origen de replicación se conoce como oriC. Esta secuencia contiene gran cantidad de adenina y timina, lo que facilita la separación de las cadenas, y es reconocida por proteínas iniciadoras que controlan este proceso, de forma que una vez unidas las proteínas iniciadoras al ADN provocan el desenrollamiento de estas regiones de fácil desnaturalización.

A continuación las proteínas iniciadoras reclutan el resto de proteínas que conforman el replisoma y que son necesarias para la síntesis de ARN y ADN, empezando por la helicasa. Esta enzima, generalmente con forma de anillo y de alta procesividad, se une a la región de ADN monocatenario resultante del desenrollamiento, desplazándose a lo largo del ADN mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 5' → 3' en la hebra rezagada y 3' → 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble hélice. El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadas proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins, proteínas ligantes de DNA monocatenario) encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al DNA conforme avanza la helicasa es rápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto lel replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a continuación la brecha.

En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki).

La mitad del dímero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.

En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. Para ello intervienen una serie de enzimas: la enzima RNasa H ("H" de híbrido ARN-ADN) elimina el cebador a excepción del ribonucleótido directamente unido al ADN; la ADN Pol I elimina este ribonucleótido gracias a su actividad exonucleasa 5' → 3' y rellena el hueco con ADN quedando una molécula completa a excepción de una rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena reparada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.

Al principio



Análisis moleculares de ADN

Estructura del ADN

El término Sistemática Molecular es utilizado para referirse a la sistemática macromolecular: el uso del ADN y del ARN para inferir relaciones de parentesco entre los organismos (también llamados, para evitar confusiones, análisis moleculares de ADN, que implican análisis de secuencias de ADN entre otros métodos). Si bien técnicamente, los métodos que implican el uso de isozimas y flavonoides también son moleculares, usualmente son tratados en apartados diferentes.

La aplicación de la información sobre los ácidos nucleicos a la Biología Sistemática ha tenido un desarrollo espectacular a partir de la década del '90. Los datos moleculares han revolucionado la forma en que la Sistemática establece relaciones de parentesco, aunque no por las razones sugeridas en un primer momento.

El ADN está presente en todas las células y es el responsable de codificar la información genética del organismo, de una forma similar a que en los libros está codificada la información que contienen en forma de letras y palabras. La estructura del ADN es de una molécula lineal que se suele representar con forma de escalera de caracol, siendo los lados de la escalera cadenas lineales de nucleótidos (cada uno de ellos contiene una base nucleotídica), cada nucleótido está unido a un nucleótido del otro lado de la escalera por puentes de hidrógeno, que suelen ser representados por los peldaños de la escalera.

Para "leer" la información contenida en el ADN se suele tomar una sola de las hebras de la escalera, y leer su secuencia de nucleótidos. Sólo hay 4 posibles nucleótidos, normalmente representados por su inicial en mayúscula: A (Adenina), T (Timina), C (Citosina), y G (Guanina). Para formar los "peldaños de la escalera", la adenina sólo puede estar unida a la timina, y viceversa, y la citosina sólo puede estar unida a la guanina, y viceversa (regla mnemotécnica: Aníbal Troilo / Carlos Gardel). Por eso cuando se ha leído una sola de las hebras del ADN, ya se tiene también la información de la complementaria.

La cantidad de ADN leído se mide en número de bases nucleotídicas, así se pueden encontrar unidades de medición como las "kilobases" (una kilobase = mil bases de ADN leídas).

Las mutaciones a las que es sujeto el ADN son: las mutaciones que reemplazan una base por otra (por ejemplo una adenina por una guanina debido al efecto "tunel del proton" donde por acción de la luz UV se forma temporalmente un tercer enlace y si la duplicación del ADN sucede antes que su reparación el cambio de base se convierte en permanente), las mutaciones en que desaparece un trozo de ADN ("deleciones"), las mutaciones en que un trozo de ADN se escinde y se vuelve a unir al resto en otro lugar diferente ("traslocaciones"), las mutaciones en que se duplica una porción del ADN, entre otras. También hay mutaciones en que un trozo de ADN de otra especie es traído por vectores (por lo general virus) e integrado al ADN de la especie estudiada, las llamadas "transferencias horizontales de ADN".

Algunas circunstancias hacen que la tasa de mutaciones sea más alta en algunos organismos que en otros (por factores ambientales, por ejemplo exposición a agentes mutágenos; o por factores genéticos, por ejemplo una ineficiencia en los mecanismos de reparación del ADN).

Debido a que en una misma especie los organismos pueden intercambiar información genética en forma fluida (por ejemplo mediante la reproducción sexual en los que la poseen), las mutaciones que no inducen la muerte del organismo suelen ser transferidas a las generaciones siguientes, dispersándose en la población. Esto se conoce como "acumulación de mutaciones" dentro de una población. Como el intercambio de información genética entre organismos de especies diferentes es muy baja o nula, las mutaciones ocurridas dentro de una población (y a la larga, dentro de una especie) se mantienen dentro de esa población, y de esa especie.

La Biología Sistemática es la rama de la Biología que se ocupa de establecer las relaciones de parentesco entre los taxones de organismos, también llamada filogenia de los organismos. Para ello la Biología Sistemática asume en un principio que todos los organismos del planeta tenemos un antecesor común, y que los organismos más emparentados tendrán más similitudes entre sí que las que tendrán los organismos más lejanamente emparentados. Para saber cuán similares son dos organismos entre sí la Sistemática se vale de caracteres: se establece un carácter que puede tener diferentes estados, y se observa en los diferentes organismos, qué estados del carácter están presentes (por ejemplo flores rojas/flores blancas).

Para que un carácter sea útil en Biología Sistemática, es fundamental que exista variación de ese carácter en los diferentes organismos estudiados (dicho de otra forma, que tenga "diferentes estados del carácter"). Por eso el interés de la Sistemática Molecular se centra en las mutaciones, que dan como resultado caracteres que son compartidos por algunos taxones pero no por otros, y por lo tanto encontrar un mismo carácter en dos taxones diferentes puede ser indicador de que en algún momento esos taxones pertenecían a la misma especie.

En principio se asume que los organismos que poseen el mismo estado del carácter están más emparentados entre sí que los organismos que poseen un estado diferente del carácter, pero no siempre es así. La Biología Sistemática tiene que lidiar con dos fantasmas que oscurecen la información filogenética: las reversiones y las convergencias. En las reversiones, un estado del carácter vuelve a un estado ancestral (por ejemplo flores blancas -> flores rojas -> flores blancas). En las convergencias, dos especies no emparentadas, por eventos de mutaciones independientes, terminan por poseer el mismo estado del carácter (por ejemplo flores rojas -> flores blancas en los dos casos).

Los pioneros en proponer los datos moleculares como caracteres para su uso en el campo de la Biología Sistemática, aseguraban que los datos moleculares son más adecuados que los morfológicos para reflejar la verdadera filogenia de los organismos, debido a que los datos moleculares reflejan cambios a nivel del genoma, que se pensaba que estaba menos sujeto a convergencia evolutiva y paralelismo de lo que lo estaban los caracteres morfológicos.

Esta asunción temprana hoy en día parece ser incorrecta. Los datos moleculares están en realidad sujetos a muchos de los mismos problemas que tienen los datos morfológicos. La mayor diferencia es simple: hay muchos más datos moleculares que datos morfológicos disponibles, con el agregado de que su interpretación es más fácil también: una adenina será siempre una adenina, pero por ejemplo las hojas compuestas pueden tener un aspecto muy diferente en plantas diferentes.

En muchos casos, la cantidad de información que suministraron los datos moleculares ha permitido la ubicación de taxones que siempre han sido problemáticos (por ejemplo Hydrangeaceae fue tradicionalmente ubicada cerca de las saxifragáceas pero ahora está claro que no están relacionadas, sino que Hydrangeaceae es parte del orden Cornales). Ha sido más bien raro que los datos moleculares sugirieran algo completamente nuevo, aunque ha habido algún que otro caso dramático, como la monofilia del clado del glucosinolato y la ubicación de Limnanthaceae; la inclusión de Vochysiaceae en los Myrtales; y la documentación de introgresión entre especies que aparentemente eran interestériles.

Los taxónomos se han valido de diversas formas de analizar el ADN, aunque hoy en día predomina el análisis directo de las secuencias, también se han utilizado otros métodos como el mapeo de sitios de restricción.

Los primeros estudios moleculares consistieron de mapeos de sitios de restricción. Para eso se extraía el ADN y luego se lo mezclaba con enzimas de restricción, que lo cortaban en secuencias específicas (por ejemplo la enzima BamHI corta el ADN en todos los sitios en que la secuencia sea GGATCC). Luego se utilizan métodos para separar los trocitos de ADN según su tamaño, y esa información dada por varias enzimas de restricción se utilizaba para reconstruir la secuencia de ADN por laboriosos métodos.

El mapeo de sitios de restricción sigue siendo común para estudiar la variación en el genoma del cloroplasto y el ARN ribosómico, particularmente entre especies congenéricas y a veces dentro de cada especie también.

La secuenciación de genes, partes de genes, o incluso de regiones no codificantes es muy utilizada hoy en día en sistemática. La secuenciación es la determinación del orden preciso en que se encuentran los nucleótidos (Adenina, Timina, Citosina o Guanina) en un trozo de ADN dado. La dificultad más grande de la secuenciación es la de obtener una cantidad suficiente de ADN para trabajar. Primero se utilizaron librerías de genes, donde las bacterias replicaban los fragmentos de ADN cortados con enzimas de restricción, este laborioso método ahora fue reemplazado por el uso de la técnica del PCR. Una desventaja del PCR es que a veces introduce errores en la secuencia, lo que puede afectar la estimación de la filogenia, particularmente si las secuencias a comparar son muy similares. Una forma de disminuir estos errores es secuenciar las dos cadenas de ADN, y algunas revistas científicas no aceptan trabajos realizados sobre una sola de las cadenas.

La secuenciación directa por PCR puede no distinguir entre múltiples copias de un mismo gen, o entre diferentes alelos de un gen (lo que sí pueden hacer las librerías de ADN).

Por razones históricas la mayor cantidad de caracteres del ADN pertenecen al ADN del cloroplasto y al ADN que codifica para el ARN ribosomal. Esto fue así porque estos trozos de ADN son abundantes en la célula de las plantas, haciendo su detección por Southern blots fácil. Otro tipo de caracteres utilizado fueron los reordenamientos de ADN.

Sitios de restricción del ADN del cloroplasto tomado por métodos de mapeo de sitios de restricción. Fue muy utilizado en los '80 y sigue siendo un buen método para especies que divergieron recientemente. Para taxones más distantes el método se hace más difícil, ya que se acumulan muchas mutaciones. La variación de los sitios de restricción es mayor entre especies que dentro de una misma especie, pero dentro de las especies ya hay variación, por lo que también es útil para documentar historia de las poblaciones en una especie.

Gen cloroplastídico rbcL. Muchos sistemáticos de plantas han hecho un esfuerzo comunitario para generar una gran base de datos de secuencias del gen del cloroplasto llamado rbcL. Este gen codifica para la subunidad grande de la enzima RuBisCO, que es el aceptor de carbono más importante en todos los eucariotas fotosintéticos y en las cianobacterias. Es conocida la estructura secundaria del gen, por lo que cada aminoácido de la subunidad puede ser asignado a su correspondiente secuencia de ADN del gen. El gen fue elegido porque es prácticamente universal en todo el reino de las plantas (exceptuando sólo las plantas parásitas), es lo suficientemente largo (1428 pares de bases), no presenta problemas de alineación, y como es parte del cloroplasto está presente en muchas copias en cada célula. El entusiasmo por secuenciar al rbcL recibió un empuje con la generosidad de Gerard Zurawski, que diseñó un set de primers de PCR que distribuyó gratuitamente a cualquiera que se lo pidiera. Los árboles filogenéticos hechos con estas secuencias de rbcL han tenido una enorme influencia en nuestra visión de las relaciones dentro de las angiospermas, y los sistemas de clasificación actuales como el APG, APG II y el APW hacen referencia a ellos continuamente. En particular se hace mucha referencia al trabajo de Chase et al. publicado en 1993 en el Annals of the Missouri Botanical Garden, que generó una filogenia para todas las plantas con semilla usando 499 secuencias de rbcL. Los árboles filogenéticos publicados no eran los más cortos posibles, algunas secuencias terminaron siendo en realidad pseudogenes, y familias enteras fueron representadas por una sola secuencia, entre otros problemas. Análisis subsiguientes de esta base de datos de 499 taxones ha encontrado numerosos árboles filogenéticos distintos igualmente cortos, muchos de ellos muy diferentes de los presentados en esa publicación (Rice et al. 1997). En otras palabras, los resultados deben ser interpretados con precaución, punto que los autores de la publicación original reconocieron. Aún así el árbol filogenético de Chase et al. es muy citado y fue tomado como punto de partida por muchos proyectos de investigación.

Una de las limitaciones del rbcL como marcador filogenético es su tasa de mutaciones baja. La proteína que codifica es muy definida al nivel de los aminoácidos que codifica, y las mutaciones no suelen sobrevivir. Por lo tanto el gen rbcL no es útil para inferir relaciones filogenéticas entre géneros muy emparentados. Para eso se han utilizado otros genes cloroplastídicos.

Todos los genes citados hasta ahora son parte del mismo genoma no recombinante que el rbcL, por lo que siguen el rastro de la misma historia familiar (por lo general materna, al ser genes cloroplastídicos).

ADN que codifica para ARN ribosomal o "ARNr". El ARN ribosomal primero fue secuenciado directamente, sin referencia a los genes que lo codificaban, debido al alto número de copias presente en cada célula, lo que hacía fácil su extracción y secuenciación. Al principio fueron los únicos genes del núcleo de la célula con un número de copias lo suficientemente alto como para extraerlo y secuenciarlo. Estos genes son muy variables aún al nivel de la población. Han sido útiles en estudios de estructuras de las poblaciones y patrones de hibridación.

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Haplogrupos de ADN mitocondrial humano

En genética humana, son los haplogrupos determinados por las variaciones encontradas en el ADN mitocondrial humano (ADNmt). Estos haplogrupos trazan la ascendencia matrilineal hasta los orígenes de la especie humana en África y desde allí, a su subsiguiente dispersión por toda la superficie del planeta.

Los haplogroupos conocidos son actualmente designados así: A, B, C, CZ, D, E, F, G, H, HV, I, J, JT, K, L0, L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, M, N, O, P, pre-HV, pre-JT, Q, R, S, T, U, UK, V, W, X, Y, y Z.

La mujer - o el grupo de mujeres - de que provienen estos grupos, se considera como el más reciente antepasado femenino común de todos los humanos vivos y se designa como la Eva mitocondrial.

Se han formulado hipótesis de las migraciones humanas, basadas en el estudio del ADN mitocondrial, que coinciden en localizar el origen de la especie Homo sapiens en África hace 140 a 200 mil años. De los haplogrupos de ADN mitocondrial humano, el más antiguo sería L1, que es aun frecuente entre los khoisan (bosquimanos, khoikhoi) y otros grupos humanos relacionados con ellos, así como entre los pigmeos Biaka. De este haplogrupo se originaron dentro de Africa, L2 y L3.

El haplotipo L2 se difundió por toda Africa con la expansión bantú. L2b y L2c surgieron en Africa occidental y L2d en Mauritania. L3 se originó en Africa oriental, se difundió por el continente y fuera de él. Portadores de este haplogrupo salieron de Africa hace 90 a 50 mil años y sus descendientes poblaron los demás continentes. Restos de una primera migración humana desde el norte de Africa al Asia occidental han sido encontrados, pero no se han registrado descendientes de ella, tal, vez porque pereció durante la desertificación del Medio Oriente durante un cambio climático.

Los haplotipos L4, L5, L6 Y L7 también derivan de L1, son pequeños grupos que se han encontrado en algunas poblaciones africanas, por ejemplo en Tanzania y Etiopía.

De los descendientes de los primeros pobladores que caminaron por el sur de Asia, tras pasar desde el actual Djibuti un istmo o estrecho hasta el actual Yemen, surgió el haplotipo M que se extendió desde la India al oriente de Asia, Australia y Melanesia. Hasta Papúa Nueva Guinea llegó una variante Q, de M.

Entre quienes poblaron tempranamente el oriente de Asia se originaron los haplogrupos C, Z, E, D y G. En la India y Melanesia es frecuente G; en tanto en Malasia, Taiwán, Filipinas, Borneo y Papúa Nueva Guinea se ha encontrado E, lo que sugiere una difusión a partir del sureste de Asia. El haplogrupo Z se difundió desde Asia central al norte de China y Corea y hacia el norte de Europa, donde es frecuente entre los Sami.

Asia central es considerada también el origen de C, en tanto se estima que D surgió en Asia oriental. Portadores de C y D llegaron hasta Siberia y desde allí pasaron a las Américas. La predominancia de estos haplogrupos en el extremo sur de América es una prueba de que llegaron con los primeros pobladores del continente (paleoamerindios).

En sentido opuesto, entre quienes regresaron desde la India hacia occidente hace 45.000 años surgió el haplogrupo M1 que se encuentra hoy en Africa.

El haplogrupo N se desarrolló hace unos 57.000 años entre los migrantes que pasaron de Africa a Asia, pero no hay acuerdo entre los expertos si proviene de una única migración que se escindió y en la corriente norte se originó N, o si se trató de otra migración por Sinaí, posterior, hace 50.000 años.

Los portadores de N marcharon hacia la región del Caspio, donde se originaron los haplogrupos A y X y hacia el Cáucaso donde surgieron I y W. A se difundió por el oriente de Asia, Siberia y las Américas y es muy frecuente entre los Inuit, Na Dene, Sioux, Aztecas, Mayas, Taínos y Chibchas. Los X e I eran portados por los pobladores de Europa, donde I alcanzó amplia expansión, en tanto W se difundió por los Urales y el Báltico. Se debate actualmente si X llegó a América procedente de Asia o de Europa noroccidental, pero no hay duda de que arrivó en el Paleolítico superior y se ha encontrado en poblaciones nativas actuales y en restos precolombinos al oriente de Norteamérica y en la Amazonia.

Otros N de Anatolia originaron el haplogrupo R que tuvo gran expansión. Por una parte, por el Cáucaso se difundió hacia Europa, donde originó los haplogrupos K y U. Este último tuvo amplia difusión durante el Paleolítico inferior europeo, desarrollando variantes como U8a propia del País Vasco; y las variantes U5 y U6 encontradas en el el norte de Africa. La variante U6b1 característica de los primeros pobladores de las islas Canarias.

La rama HV de R, originó el haplotipo V que se encuentra actualmente entre los sami y los vascos y el haplotipo H que es común en el Medio Oriente y regresó al Africa.

Por otra parte entre los portadores de R que migraron hacia el oriente, surgieron el haplogrupo B, que llegó hasta Polinesia, Australia, Indonesia, Taiwán, Filipinas y las Américas, a donde puedo haber llegado con una migración bordeando el Pacífico norte, ya que no se ha encontrado en Siberia ni Alaska ni Canadá; y el haplogrupo F, común en China y Japón, donde también es fecuente el F que procede directamente de N.

Durante el Neolítico la rama JT de N se expandió, encontrándose actualmente al occidente del Caspio. El T originario de Anatolia o Mesopotamia se encuentra tanto en Medio Oriente como en el Báltico y los Urales la variante T2 es predominante entre los samaritanos; en tanto que el J se expandió por Europa y el norte de Africa, en donde también se ha encontrado el haplotipo N1, que introdujeron migrantes de regreso.

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ADN recombinante

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas heterólogas, es decir, de diferente origen. Generalmente se aplica este nombre a moléculas producidas por la unión artificial y deliberada, in vitro, de ADN proveniente de dos organismos diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se produce una modificación genética que permite la adición de una nuevo ADN al organismo conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. Por ejemplo la producción de una proteína no presente en el organismo, estas proteínas producidas a partir de ADN recombinante se llaman proteínas recombinantes Este proceso es mediante técnicas de ingeniería dirigida y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención del hombre dentro de la célula.

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea un virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen e incluso en algunos casos, para tratar una enfermedad genética en cualquier especie con fines económicos y científicos.

Se distingue entre el ADN recombinante natural, y el ADN recombinante sintético; el primero es el que se genera de manera biológica dentro de los organismos, como por ejemplo, en la fecundación del óvulo por el espermatozoide; el segundo, es el obtenido por los científicos y usado en ingeniería genética para innovaciones biotecnológicas, también se denomina ADN quimérico.

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre,entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento,interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas. En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción. Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

En la siguiente animación puede verse "en vivo" la actuación de las enzimas de restricción.

En esta sencilla animación, tienes dos trozos de ADN de dos especies distintas. Especie A de color rojo y especie B de color azul. Puedes separar las hebras haciendo clic con el ratón y arrastrando. Romperás las hebras como lo hace una enzima de restricción. Después puedes unir las hebras de las dos especies distintas. Es un juego, pero así es como se hace.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

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Source : Wikipedia